01 背景

Bowtie 是一个超快速、内存高效的短读取比对器，适用于来自下一代测序仪的短DNA序列（读取）。序列比对统计，一般是基因组会贴使用，转录组用的较少。它和STAR相比性能差不多（后续出STAR）。

02 参考

https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio #官网 https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie2/

03 安装

讯享网下载 wget -c https://jaist.dl.sourceforge.net/project/bowtie-bio/bowtie2/2.5.2/bowtie2-2.5.2-linux-x86_64.zip #解压 unzip bowtie2-2.5.2-linux-x86_64.zip

04 使用

4.1 bowtie

./bowtie2 -h bowtie2 [选项]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r> | --interleaved <i> | -b <bam>} [-S <sam>] <bt2-idx> 索引文件名前缀（不包括末尾的 .X.bt2）。 注意: Bowtie 1 和 Bowtie 2 的索引不兼容。 <m1> 带有 #1 伴侣的文件，与 <m2> 中的文件配对。 可以是 gzip 压缩的（扩展名: .gz）或 bzip2 压缩的（扩展名: .bz2）。 <m2> 带有 #2 伴侣的文件，与 <m1> 中的文件配对。 可以是 gzip 压缩的（扩展名: .gz）或 bzip2 压缩的（扩展名: .bz2）。 <r> 带有未配对读取的文件。 可以是 gzip 压缩的（扩展名: .gz）或 bzip2 压缩的（扩展名: .bz2）。 <i> 带有交错配对端 FASTQ/FASTA 读取的文件 可以是 gzip 压缩的（扩展名: .gz）或 bzip2 压缩的（扩展名: .bz2）。 <bam> 文件是按读取名称排序的未对齐 BAM。 <sam> SAM 输出的文件（默认为: stdout） <m1>、<m2>、<r> 可以是逗号分隔的列表（无空格）并且可以多次指定。例如：'-U file1.fq,file2.fq -U file3.fq'。 选项（默认值在括号中）: 输入: -q 查询输入文件为 FASTQ .fq/.fastq（默认） --tab5 查询输入文件为 TAB5 .tab5 --tab6 查询输入文件为 TAB6 .tab6 --qseq 查询输入文件为 Illumina 的 qseq 格式 -f 查询输入文件为 (多-)FASTA .fa/.mfa -r 查询输入文件为一行一个序列的原始数据 -F k:<int>,i:<int> 查询输入文件为从 FASTA 文件 <s> 中提取的子字符串（k-mer）形成的连续 FASTA， 并在参考序列的偏移量 1, 1+i, 1+2i ... 结束处进行对齐 -c <m1>、<m2>、<r> 是序列本身，而不是文件 -s/--skip <int> 跳过输入中的前 <int> 个读取/对（无） -u/--upto <int> 在第一个 <int> 个读取/对后停止（无限制） -5/--trim5 <int> 从读取的 5'/左端修剪 <int> 个碱基（0） -3/--trim3 <int> 从读取的 3'/右端修剪 <int> 个碱基（0） --trim-to [3:|5:]<int> 修剪超过 <int> 个碱基的读取，从 3' 或 5' 端开始 如果未指定读取端，则默认为 3（0） --phred33 质量值为 Phred+33（默认） --phred64 质量值为 Phred+64 --int-quals 以空格分隔的整数编码的质量值 预设： 等同于： 对于 --end-to-end: --very-fast -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 --fast -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 --sensitive -D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15（默认） --very-sensitive -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50 对于 --local: --very-fast-local -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00 --fast-local -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75 --sensitive-local -D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75（默认） --very-sensitive-local -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50 对齐: -N <int> 种子对齐中的最大错配数；可以是 0 或 1（0） -L <int> 种子子字符串的长度；必须大于 3，小于 32（22） -i <func> 种子子字符串间隔与读取长度的关系（S,1,1.15） --n-ceil <func> 对齐中允许的最大非 A/C/G/T 数的函数（L,0,0.15） --dpad <int> 在 DP 表的两侧包含 <int> 个额外的参考字符（15） --gbar <int> 禁止在读取极端的 <int> 个核苷酸内出现间隙（4） --ignore-quals 将所有质量值视为 Phred 刻度上的 30（关闭） --nofw 不对齐读取的正向（原始）版本（关闭） --norc 不对齐读取的反向互补版本（关闭） --no-1mm-upfront 在尝试扫描**种子对齐之前不允许 1 个错配对齐 --end-to-end 整个读取必须对齐；无剪切（开启） 或 --local 局部对齐；端部可能被软剪切（关闭） 计分: --ma <int> 匹配奖励（对于 --end-to-end 为 0，对于 --local 为 2） --mp <int> 错配的最大惩罚；质量低 = 惩罚低（6） --np <int> 读取/参考中非 A/C/G/T 的惩罚（1） --rdg <int>,<int> 读取间隙开启、扩展惩罚（5,3） --rfg <int>,<int> 参考间隙开启、扩展惩罚（5,3） --score-min <func> 接受的最小对齐分数与读取长度的关系 （对于局部对齐为 G,20,8，对于端到端为 L,-0.6,-0.6） 报告: （默认） 查找多个对齐，报告**对齐，并附上 MAPQ 或 -k <int> 每个读取报告最多 <int> 个对齐；MAPQ 无意义 或 -a/--all 报告所有对齐；非常慢，MAPQ 无意义 努力: -D <int> 在连续 <int> 次扩展失败后放弃（15） -R <int> 对于具有重复种子的读取，尝试 <int> 组种子（2） 成对端: -I/--minins <int> 最小片段长度（0） -X/--maxins <int> 最大片段长度（500） --fr/--rf/--ff -1, -2 伴侣以 fw/rev, rev/fw, fw/fw 对齐（--fr） --no-mixed 抑制成对读取的未配对对齐 --no-discordant 抑制成对读取的不协调对齐 --dovetail 伴侣相互延伸时一致 --no-contain 一个伴侣对齐包含另一个时不一致 --no-overlap 伴侣有任何重叠时不一致 BAM: --align-paired-reads Bowtie2 默认尝试对齐未配对的 BAM 读取。 使用此选项改为对齐成对端读取。 --preserve-tags 通过将原始 BAM 记录中的标签附加到相应的 SAM 输出末尾来保留标签。 输出: -t/--time 打印搜索阶段所需的实际时间 --un <path> 将未对齐的未配对读取写入 <path> --al <path> 将至少对齐一次的未配对读取写入 <path> --un-conc <path> 将未协调对齐的对写入 <path> --al-conc <path> 将至少协调对齐一次的对写入 <path> （注意：对于 --un、--al、--un-conc 或 --al-conc，将 '-gz' 添加到选项名称中，例如 --un-gz <path>，以 gzip 压缩输出，或添加 '-bz2' 以 bzip2 压缩输出。） --quiet 除了严重错误外，不向 stderr 打印任何内容 --met-file <path> 将指标发送到 <path> 处的文件（关闭） --met-stderr 将指标发送到 stderr（关闭） --met <int> 每 <int> 秒报告内部计数器和指标（1） --no-unal 抑制未对齐读取的 SAM 记录 --no-head 抑制标题行，即以 @ 开头的行 --no-sq 抑制 @SQ 标题行 --rg-id <text> 设置读取组 id，在 @RG 行和 RG:Z: 可选字段中反映 --rg <text> 向 SAM 标题的 @RG 行添加 <text>（"lab:value"）。 注意：仅在设置 --rg-id 时打印 @RG 行。 --omit-sec-seq 在次级对齐中，SEQ 和 QUAL 字段使用 '*'。 --sam-no-qname-trunc 抑制在第一个空白处截断读取名的标准行为 以产生非标准的 SAM，但代价是生成非标准 SAM。 --xeq 使用 '='/'X' 而不是 'M' 来指定 SAM 记录中的匹配/错配。 --soft-clipped-unmapped-tlen 报告 TLEN 时排除软剪切的碱基 --sam-append-comment 将 FASTA/FASTQ 注释附加到 SAM 记录中 性能: -p/--threads <int> 启动的对齐线程数（1） --reorder 强制 SAM 输出顺序与输入读取的顺序匹配 --mm 使用内存映射 I/O 进行索引；许多 'bowtie' 可以共享 其他: --qc-filter 根据 QSEQ 过滤器过滤掉不良读取 --seed <int> 随机数生成器的种子（0） --non-deterministic 任意种子随机数生成器，而不是使用读取属性 --version 打印版本信息并退出 -h/--help 打印此使用信息

4.2 bowtie2-build

讯享网./bowtie2-build -h 用法：bowtie2-build [选项]* <reference_in> <bt2_index_base> reference_in 以逗号分隔的含参考序列的文件列表 bt2_index_base 将 bt2 数据写入此目录/基本名的文件中 * Bowtie 2 索引将与 Bowtie v1.2.3 及更高版本兼容。* 选项： -f 参考文件为 Fasta 格式（默认） -c 命令行中给出的参考序列（作为 <reference_in>） --large-index 强制生成的索引为“大”索引，即使参考序列少于 40 亿核苷酸 --debug 使用调试二进制文件；更慢，启用断言 --sanitized 使用已清理的二进制文件；更慢，使用 ASan 和/或 UBSan --verbose 记录发出的命令 -a/--noauto 禁用自动的 -p/--bmax/--dcv 内存拟合 -p/--packed 内部使用压缩字符串；更慢，内存占用更少 --bmax <int> 块状后缀数组构建器的最大桶大小 --bmaxdivn <int> 最大桶大小作为参考长度的除数（默认：4） --dcv <int> 块状差分覆盖周期（默认：1024） --nodc 禁用差分覆盖（算法变为二次方） -r/--noref 不构建 .3/.4 索引文件 -3/--justref 仅构建 .3/.4 索引文件 -o/--offrate <int> 每 2^<int> 个 BWT 字符抽样一次 SA（默认：5） -t/--ftabchars <int> 初始查找中消耗的字符数（默认：10） --threads <int> 线程数 --seed <int> 随机数生成器的种子 -q/--quiet 详细输出（用于调试） --h/--help 打印此消息并退出 --version 打印版本信息并退出

05 常用命令行

bowtie一般为RSEM等内置程序，它和STAR一样均承担比对计算的任务。常用bowtie2-build，和bowtie2两个程序。

讯享网

1 参考基因组建立索引 bowtie2-build -f XX.fasta --threads 10 bwXX #-f：指明index的参考fasta文件 #<bwXX>：生成的index文件的前缀 #-xs输出索引 2 序列比对 bowtie2 -x bwXX -1 read1.fq.gz -2 read2.fq.gz -S read_bwXX.sam -p 10 #-x：由bowtie2-build所生成的索引文件的前缀 #-1：双端测序的文件1 #-2：双端测序的文件2 #-U：单端测序的文件，可以为多个文件，用逗号隔开 很少用 #-S：所生成的SAM格式的文件前缀 #-p：线程数 具体详见上一小节

06 参考文献

Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 2012 Mar 4;9(4):357-9. doi: 10.1038/nmeth.1923. PMID: ; PMCID: PMC.