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摘要:

 

如何实现蛋白药物的准确定量一直是生物技术药物质量控制中的重要课题。本文将蛋白含量测定方法系统地分成 3 类: 标准定量法、比色分析法以及紫外吸收法，并对每种方法如何实现准确定量分别进行阐述。此外，本文还提出一种测定抗体药物偶联物中蛋白含量的方法，为该种重组蛋白类药物蛋白含量的准确测定提供了参考

一 前言

重组蛋白类药物是由基因工程技术改造的“工程菌”或“工程细胞”批量表达出的人体功能蛋白或其突变体， 用于弥补机体由于先天基因缺陷或后天疾病等造成的体内相应功能蛋白的缺失。目前由于政策支持、市场需求大等原因， 重组蛋白药物正处于快速发展的黄金时期。而完善的质控是重组蛋白类药物成功上市的必要条件， 因此建立成熟的质量评价技术体系迫在眉睫。

蛋白含量测定是重组蛋白质药物质量控制中的重要指标之一，准确的蛋白质含量测定对比活性计算、残留杂质的限量控制以及产品的分装均具有重要意义。本文就目前常用的蛋白定量方法根据其原理、应用及特点进行分类探讨。

二 常用蛋白定量方法探讨

除《中国药典》2020年版附录收载的 6 种方法外，本文还引入了在重组蛋白分析中应用越来越广的氨基酸分析法。根据各方法的特点，以下分 3 类进行探讨，即: 标准定量法( 包括: 凯氏定氮法和氨基酸分析法) 、比色分析法( 包括:Lowry 法、双缩脲法、BCA 法及 Bradford 法) 、紫外吸收法。

2.1 标准定量法

凯氏定氮法 凯氏定氮通过含氮量分析进行蛋白含量测定，反应中消耗的盐酸滴定液可溯源至恒重无水碳酸钠的重量， 可作为含量标准品溯源的方法。

通常情况下重组蛋白类药物纯度极高，采用该法时无须考虑其他含氮物质的影响。但是， 如果在制剂过程中使用到含氮添加剂， 则需通过总氮量减去非蛋白氮量间接获得蛋白含氮量。此外， 凯氏定氮法通过含氮量换算出蛋白含量， 其换算系数 F 需根据蛋白分子式精确计算。

氨基酸分析法 氨基酸分析能够测定组成蛋白质的各种氨基酸的含量及所占比例。测定时， 一般采用基于液相的常规酸解法。首先对蛋白样品进行酸水解， 得到游离氨基酸溶液; 然后用异硫氰酸苯酯( PITC) 进行柱前衍生， 赋予氨基酸以疏水结构和吸收基团; 最后使用液相进行分离并检测。计算时，先通过混标对各个氨基酸分别定量，再经由一系列公式获得蛋白含量。由于各种氨基酸的水解情况不尽相同，为了获得准确的蛋白含量，建议计算时使用在水解中稳定、在蛋白中含量较多、具有足够分离度且回收性良好的氨基酸。

凯氏定氮法和氨基酸分析法是目前国际上公认的两种测定蛋白含量的“金标准”。相较于其他方法， 该类方法操作较烦琐， 目前主要被用来标定蛋白含量用同质标准品。其中，凯氏定氮法最大的缺点就是耗样量大，一次测定约消耗 20 mg 蛋白。对于剂量小、成本高的重组蛋白药物， 其分装量往往较低，如: 一些细胞因子的分装量往往只有几百微克左右，甚至更低。进行协作标定时，需要合并十几甚至几十支标准品，最后所剩无几，无法满足发放需求。相对于凯氏定氮法耗样量较大的缺点，氨基酸分析法样品需求量低，尤其适用于价格昂贵、产量较低的生物制品。此外，氨基酸分析法还能够进行消光系数计算及氨基酸组成分析，为重组蛋白的一级结构确认及功能研究提供依据。值得注意的是，对于高度糖基化蛋白样品的蛋白定量，氨基酸分析法并不适用。

2.2 比色分析法

Lowry 法、双缩脲法、BCA法以及Bradford法均是根据蛋白中特定氨基酸或基团的显色反应为基础，通过比较显色深度来确定蛋白含量。采用该类方法定量时，需要结合蛋白标准品，而选择合适的标准品是该类方法准确定量的关键。以前多采用牛血清白蛋白或者人白蛋白作为替代标准品用于蛋白定量，但是不同蛋白的氨基酸组成不同，其理化性质不同，会造成系统误差，不能准确反映待测蛋白的真实含量。

因此，只有采用与待测样品为相同材质的原料作为标准品，即建立同质标准品， 才能有效避免上述系统误差。然而，对于开发早期的重组蛋白药物，其同质标准品一般情况下无法获取，这在一定程度上限制了此类方法在该阶段的应用。而一旦获得同质标准品，通过“标准定量法”对其标定后，便可采用此类方法进行蛋白含量的日常检测。

此外，相较于其他方法，该类方法由于形成的蛋白－染料复合物具有极高的消光系数，大大提高了检测的灵敏度，因此特别适用于蛋白质的微量测定。但是， 该类方法的干扰物质较多，因此需慎重选用。

2.3 紫外吸收法

由于 Trp、Tyr 以及Phe结构中的苯环含有共轭双键，因此赋予了蛋白质在280nm处的紫外吸收特性。根据朗伯－比尔定律，在已知光程和消光系数的前提下，通过测定蛋白样品280nm的OD值，即可获得蛋白含量。因此，如何确定消光系数是该法最核心的问题。

 经验公式法 Edelhoch提出并证明了Trp、Tyr、S-S模型化合物在6 mol·L－1盐酸胍变性处理条件下，可被用于估算同等条件下其他非折叠蛋白的消光系数。为了能够计算出接近自然折叠状态下蛋白质的消光系数，Pace等对公式中种氨基酸的消光系数进行了校正并重新赋值，最终得到了如下公式:

ε280 = ( 5 500×a Trp) +( 1 490×b Tyr) +( 125×c S－S) ( 1)

E =ε 280 /Mr其中，5 500、1 490、125 分别为 Trp、Tyr、S－S( 胱氨酸) 校正后的摩尔消光系数。利用该法得到的消光系数通常也被称为理论消光系数，其与盐酸胍变性法得到的消光系数之间的偏差约为 4% 左右。偏差的大小与蛋白质氨基酸组成中色氨酸的含量相关，色氨酸含量越高，偏差越小; 反之， 越大。如果蛋白质氨基酸组成中没有色氨酸，则偏差一般大于 10%。这与色氨酸消光系数大，对蛋白在280nm 处吸光度的贡献最大相关，且色氨酸对 pH、温度条件变化均不敏感。

氨基酸分析法消光系数可以通过蛋白质的序列信息得到，也可以通过对相应蛋白的氨基酸分析结果计算得到。虽然前者较为方便快捷，但在实际应用中也有局限。主药学研究·要因为在蛋白成品制剂中，辅料及添加剂的加入可使供试品的pH 值发生变化，影响酪氨酸残基的离子态，进而影响蛋白吸光度。所以， 要想得到准确的消光系数常采用氨基酸分析法。该法先通过氨基酸分析法对蛋白准确定量， 然后通过朗伯－比尔定律得到准确的消光系数，即:

E = A280 /( l × m /V) 

总之， 相较于其他几种方法，紫外吸收法具有操作简单、成本低、无污染且测定后样品可以回收使用的优势。更重要的是，通过准确测定蛋白消光系数， 解决了该法一直饱受诟病的定量不准确的弊端。此外，对于通过基因重组技术获得的重组蛋白类药物，其序列信息往往已知，消光系数的获取变得极为快速简单，因此， 目前绝大多数重组蛋白类药物的蛋白质含量测定方法为紫外法。但是，在确定消光系数时，应注意经验公式法无须实验操作，只需知道蛋白中Trp、Tyr以及 S－S 的数量即可对消光系数进行计算，也可将DNA序列输入生物信息学软件(ExPASy) 直接读取;但不足的是，该法在一定程度上忽略了蛋白三维空间结构对消光系数的贡献。

 实验测定法弥补了该方面的缺陷，均考虑了蛋白空间结构的影响，因而得到的消光系数更加接近自然折叠状态，其中尤以氨基酸分析法所得消光系数最为准确。因此，建议在实际应用中，增加对消光系数的实验确证和比较过程。另外， 对于蛋白结构中不含色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的重组蛋白类药物，紫外吸收法不适用。

三 总结

综上， 本文主要介绍了目前常用的测定重组蛋白类药物中蛋白含量的方法。这些方法要求样品具有极高的纯度，且所含辅料不得干扰蛋白含量的测定， 适用范围通常是经过纯化后的样品。而对于含有较多非目标蛋白的工艺样品或者辅料中含有添加蛋白的蛋白成品，其蛋白含量的测定则必须采用特异性较强的方法如基于抗原抗体特异结合原理的免疫学测定法， 或者是基于分离原理的将目标蛋白与干扰成分先分离再定量的 HPLC 法; 而这些方法不在本文的探讨范围内，每种方法都有各自的优缺点， 进行选择时， 应结合检测目的、蛋白样品的自身性质以及辅料成分进行恰当而有效地选择。

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