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甲状腺过氧化物酶(TPO)是甲状腺激素合成过程中的关键酶,参与了碘的氧化、碘化物的有机化及甲状腺激素前体的偶联反应。这些步骤是甲状腺激素T3(三碘甲腺原氨酸)和T4(四碘甲腺原氨酸)合成的重要环节。
01
TPO的分子结构与功能
TPO分子由933个氨基酸残基组成,具有一个跨膜区,细胞外部分主要由髓过氧化物酶(MPO)样结构域、补体控制蛋白(CCP)样结构域及表皮生长因子(EGF)样结构域组成。TPO的MPO样结构域是其主要的功能区,与甲状腺激素合成直接相关。
图1.TPO抗原简易说明图
02
TPO自身抗体
在自身免疫性甲状腺疾病中的作用
TPO自身抗体是自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的重要特征之一,尤其是在桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)和Graves病中。AITD患者的血清中常出现针对TPO的多克隆自身抗体,这些抗体与TPO分子特定区域结合,形成免疫显性区域(IDR)。
免疫显性区域(IDR)的研究:TPO自身抗体的表位集中在TPO的免疫显性区域(IDR),这一区域在AITD中扮演了重要的角色。研究表明,TPO的CCP样结构域和MPO样结构域的交界处是IDR的重要组成部分。这一区域对TPO抗体的免疫反应起关键作用,IDR的确定为进一步了解AITD的免疫病理机制提供了重要依据。
03
TPO结构域的功能研究
通过对TPO不同结构域的突变研究,科学家发现CCP样结构域在TPO自身抗体识别中起着至关重要的作用。删除EGF样结构域的TPO分子仍然能够被抗体识别,而删除CCP样结构域则显著降低了抗体的结合能力。这一发现表明,CCP样结构域是TPO免疫显性区域的一部分,对自身免疫性反应具有重要影响。
04
TPO抗原与抗体的国产化替代
多年来,定量检测这类自身抗体的免疫检测系统主要使用从人甲状腺纯化的天然TPO作为关键原料。根据90年代早期的研究显示,由CHO、昆虫细胞表达的重组TPO胞外结构域具有与天然TPO抗原类似的免疫学活性(图2、图3)[David L. Kendler et al.1993]。
当前市场中,anti-TPO发光试剂的应用策略主要表现为三种形式:

竞争法:温柔而精准的“回旋针”
竞争法更像一场竞争性较强的“比武”,利用样本中抗体与已知抗体之间的竞争关系来测定抗体浓度。操作过程中,将固定化抗原与已知抗体(带有发光标记)一起加入反应系统,然后再加入样本。如果样本中有抗体存在,那么它们会与固相载体上的抗原竞争结合。这一过程中,样本中的抗体越多,标记的已知抗体结合越少,发出的光信号就越弱。此方法适用于浓度较低的抗体检测,尤其适合一些小分子、难以直接检测的抗原和抗体。
间接法:强硬而敏捷的“短兵相接”
间接法是一种较为温和的检测方式。它利用抗原和抗体之间的结合来判断样本中是否存在目标抗体。在这个方法中,首先将抗原固定在固相载体上,之后加入被检测的样本中的抗体,如果样本中有抗体,它们会与固相载体上的抗原结合。然后再加入标记了发光物质的二抗(即与样本中抗体结合的第二抗体)。当系统检测到光信号时,就意味着样本中有抗体存在。这个方法适合检测抗体浓度较高、特异性较强的样本。
双抗原(TPO)夹心法:层层加固的“稳固夹击”
双抗原夹心法,顾名思义,类似“夹击”式的稳固方案。这个方法中需要两个特异性抗原,将它们分别放在固相和标记物中。当样本中的抗体与固相抗原结合后,带有发光标记的抗原会将目标抗体“夹在中间”,形成稳定的“夹心”复合物。这种方法具有高度特异性和灵敏度,常用于复杂样本检测,尤其是在检测抗体浓度较高的情况时表现出色。
千诚生物通过优化表达体系、启动子、信号肽及TPO基因序列,成功获得高表达TPO抗原的CHO稳定细胞株,表达量达到230mg/L,可大幅度降低抗原的生产成本,从而惠及下游的IVD客户。千诚生物TPO细胞株表达蛋白具有与人甲状腺纯化的天然TPO抗原相似的免疫学活性,利用异源表达系统减少人源蛋白的残留干扰,具有纯度高,稳定性好的特性,可以作为用于开发检测TPO特异性自身抗体的免疫检测试剂盒的关键原料之一。

图4. TPO抗原SDS-PAGE
截至目前,该抗原的稳定性及性能已经得到下游多家客户的验证:

图5. A客户反馈的稳定性评估

图6. A客户反馈临床相关性

图7. B客户双抗原夹心法反馈临床相关性

间接法配套抗体:千诚生物利用其特有的全人源抗体合成库及噬菌体展示平台开发了适用于anti-TPO间接法的人源抗体MC03001、MC03002、MC03003,可满足不同的客户需求,用于制备间接法的校准品与质控品。
竞争法配套抗体:千诚生物定向开发了特异性识别CCP区域的MC03004抗体及识别IDR区域的MC03005抗体。2株抗体可以相互配对并覆盖IDR和CCP核心区,与病人体内的自身抗体形成的竞争信号更加灵敏,减少漏检的概率,同时具有超高的灵敏度和绝佳的信噪比。

图8. TPO 竞争法工艺流程示意图

图9.竞争法抗体的临床相关性
产品信息

(千诚生物已推出 TG、TSHR、TSH、T3、T4 等多款创新型抗原抗体原料)
详情请咨询
公司网址:http://khonesty.com/
安徽千诚生物技术有限公司
核心技术平台介绍



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