如何设计qPCR引物序列

科技前沿 • 2025-02-23 10:14 • 阅读 57

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感谢李三多师弟的倾囊相授！

文献中寻找序列
PrimerBank 中寻找（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）

本次着重第二种方法
打开PubMed的Gene界面(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，输入需要查询的基因名称(如METTL3)，确认好种属（如小鼠），查询Gene ID
输入目标基因
讯享网
选择好种属

复制Gene ID，打开 PrimerBank,依次选好检索条件，点击Submit查询（可能等待时间稍长）。（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）
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结果如下：
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查看的细节如下：

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*

比如挑中这一对，到BLAST里验证：
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找出序列后，在Pubmed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）里的BLAST进行模拟。
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页面往下滑，选择Primer-BLAST。

由于在新窗口打开结果，我们可以尝试下一对引物，如复制粘贴Primer pair 2的正反引物进行比较。
操作同上。

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出现这个页面的话点Check查看结果

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共验证了四对引物，来看看结果比较：

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通过序列和Length定位到这个序列：

挑选引物的细节*：

①Forward和Reverseprimers 退火温度（Tm） 55-75℃，60℃为宜，且相差不超过4℃。更严格的标准有：Tm相差最好不超过1
②引物的GC含量一般为40-60%，以45-55%为宜，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大
③给出的数对引物中，Amplicon Size一般小于200，大于200初筛即可淘汰。PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80-150bp最为合适（可以延长至300 bp）
④尽可能多尝试，找出最合适的
⑤Self complementarity0-3为理想状态；self 3’ complementarity 严格＜1/4碱基数。总的来说，越低越好。对应的数值越小，非特异性扩增和引物二聚体就越少。Max Self Complementarity 默认值是8.00，Max 3’ Self Complementarity 默认值是3.00
⑥引物长度一般在15-30碱基之间。引物长度18-27bp，不大于38bp
⑦3’端碱基一般不用A，最好用T，3’端避开密码子第三位，3’端不应该有超过3个连续的C或G
⑧transcript variant是转录本的意思，具体含义可以自行百度。大多数基因都有好几个转录本，转录本越多说明这个引物越好。
⑨跨内含子的勾选，参考如下图：若出不来结果，尝试取消此筛选
⑩若别无他选，有其他干扰的物质的产物量大于1000，PCR扩增不出来此干扰产物，可考虑
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参考来源：
https://www.zhihu.com/question/
https://zhuanlan.zhihu.com/p/
https://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=&do=blog&quickforward=1&id=
https://zhuanlan.zhihu.com/p/
https://www.biomart.cn/experiment/793/2714179.htm
https://www.biomart.cn/experiment/430/457/741/43975.htm
https://www.jianshu.com/p/5fba2bc168d4

如何设计qPCR引物序列

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