亲爱小伙伴们，大家好呀！小薇了解到很多人写文章都遇到了很多困难，要么“胎死腹中”，要么只能退而求其次。这种感觉就像是范进中举、虎妞难产、黛玉暴毙一样痛苦。你们想不想摆脱这种困境，快速写出高分文章，提升实验研究的效率呢？今天小薇要给大家介绍的文章将线粒体和细胞焦亡结合在一起，非常厉害哦！快来和我一起学习吧~

1.本研究发现N端成孔GSDMD片段（GSDMD-NT）快速损伤线粒体内膜和外膜（OMM），导致线粒体数量减少、线粒体自噬、ROS、跨膜电位损失、氧化磷酸化减弱（OXPHOS），并从基质和膜间隙释放线粒体蛋白和DNA；

2.本研究表明通过心磷脂合酶（Crls1）或将心磷脂转移至OMM的磷脂扰乱酶3（Plscr3），线粒体损伤、焦亡和炎性细胞因子释放的典型和非典型炎症小体的激活受到抑制。肿瘤中的磷脂扰乱酶3（PLSCR3）缺乏会损害细胞焦亡引发的抗肿瘤免疫。（PS：想获得超全研究思路、了解更多研究套路、论文润色、生信分析等科研服务都可以扫码来找小薇哦！）

题目：线粒体内外膜的Gasdermin D通透性加速和增强焦亡

杂志：Immunity

影响因子：IF=32.4

发表时间：2023年11月

研究背景

线粒体是控制细胞命运和免疫反应的中心枢纽，它的损伤对于细胞焦亡和炎症至关重要。Gasdermin D（GSDMD）激活的炎症细胞死亡（焦亡）会导致线粒体损伤，但其潜在机制和功能后果在很大程度上尚不清楚。

研究思路

主要结果

1. 线粒体在焦亡过程中受损

通过线粒体跨膜电位敏感型线粒体远红外荧光探针（MTDR）和不敏感型线粒体绿色荧光探针（MTG）以及电位染料四甲基罗丹明甲酯（TMRM），检测了脂多糖+尼日利亚菌素处理的THP-1细胞的线粒体完整性和膜电位（图1A和1B）。通过透射电镜（TEM）显示，在加入尼日利亚菌素后，脂多糖诱导的THP-1细胞引发细胞焦亡，导致线粒体形态发生了变化。在加入尼日利亚菌素之前，线粒体是典型的卵圆形、双膜结合的囊泡，有内脊；加入尼日利亚菌素后，线粒体缩小并聚集，平均长度减少2倍（图1C和1D）。用免疫印迹法分析了尼日利亚菌素处理的THP-1培养液以及线粒体和胞浆中caspase-1、GSDMD和Pro-IL-1β的裂解、GSDMD-NT与线粒体的结合以及胞浆中线粒体内容物（IMS细胞色素c、基质ACO2和mtDNA）的释放和分泌（图1E-1G）。通过免疫印迹检测caspase-1、GSDMD和Pro-IL-1β的裂解、GSDMD-NT与线粒体结合、细胞内线粒体内容物（IMS细胞色素c、基质ACO2和mtDNA）的释放和分泌，分析了尼日利亚菌素处理的THP-1培养液以及线粒体和胞浆部分（图1E-1G）。  

讯享网

图1 焦亡损害线粒体    

2. 线粒体功能障碍发生在焦亡早期，是焦亡所必需的

通过平板阅读器，评估线粒体膜电位（TMRM强度）、细胞ROS产生（DCFDA强度）和质膜通透性（SYTOX Green摄取）。在细胞摄取SYTOX Green之前，DCFDA增加，TMRM减少，证实线粒体功能障碍先于细胞死亡（图2A）。通过流式细胞术检测MitoSOX（线粒体ROS）、DiIC1（5）（线粒体膜电位）和SYTOX Green摄取也证实了这一点（图2B）。用溴化乙锭（EB）处理iBMDM，以产生线粒体缺陷的细胞（图2C）。通过CellTiter-Glo测定，r iBMDMs缺陷细胞对经典（脂多糖+尼日利亚菌素）和非经典（转染脂多糖）炎症小体介导的焦亡具有高度抵抗性（图2D和2E）。在MitoTEMPO处理的iBMDMs中，脂多糖+尼日利亚菌素或脂多糖或dA: dT转染诱导的SYTOX Green摄取和乳酸脱氢酶（LDH）释放被减弱（图2F-2I）。通过表达酵母D-氨基酸氧化酶（DAAO），标记有核出口或定位序列和比率式的H2O2敏感的荧光生物传感器HyPer7，来局部操纵细胞内的氧化还原状态（图2J-2L）。    

图2 线粒体损伤发生在质膜损伤之前并增强细胞焦亡

3. GSDMD-NT在质膜破坏之前易位至线粒体并对其造成损害

通过活细胞共聚焦成像，在加入DOX后6小时开始跟踪GSDMD-NT 定位、质膜通透性（PI或SYTOX摄取）和线粒体损伤（MitoTracker、TMRM 和 MitoSOX）的动态。DOX后，在GSDMD-NT-BFP细胞中，MitoTracker和TMRM强度都下降。在质膜通透前至少50分钟，GSDMDNT-BFP与线粒体染料定位，证实GSDMD-NT早期靶向线粒体（图3A和3B）。在HEK293T中表达了标志标记的GSDMD-FL或-NT。18小时后，当30%表达了GSDMD-NT，通过共聚焦显微镜、结构照明显微镜和免疫电镜分析GSDMD-FL和GSDMD-NT的定位。在荧光显微镜图像中，异位的GSDMD-NT，而不是GSDMD-FL，主要与线粒体共存并在线粒体上形成点状（图3C和3D）。同样，在免疫-EM中，仅在GSDMD-NT表达细胞中，转染18小时后，抗-FLAG结合的金颗粒在线粒体中富集（图3E）。

图3 GSDMD-NT在质膜破坏前易位并损伤线粒体

4. GSDMD-NT对体外分离线粒体的损伤作用

用重组GSDMD和caspase-11处理分离的线粒体以产生活性的GSDMD-NT，并通过免疫印迹法评估线粒体的通透性，5分钟内线粒体释放出可溶性线粒体基质蛋白（ACO2）和IMS蛋白（细胞色素c和HtrA2），但不释放膜结合型COX IV。正如预期的那样，caspase抑制剂z-VAD-FMK抑制了释放。细胞色素c和HtrA2在加入t-Bid后释放，但不释放ACO2，从而在不破坏IMM凋亡的情况下触发MOMP（图4A和4B）。当线粒体与GSDMD和caspase-11共同孵育时，mtDNA也被释放，但不与单独或与t-Bid孵育（图4C）。通过MitoSOX Red和DiIC1（5）染色，GSDMD和caspase-11处理分离的线粒体也显著增加ROS和降低膜电位（图4D和4E）。在加入GSDMD和caspase-11之前，将分离的线粒体与DSF预先孵育。DSF阻断线粒体细胞色素c和mtDNA的释放，证实GSDMD-NT孔对线粒体具有通透性（图4F和4G）。    

图4 GSDMD-NT对分离的线粒体通透性和损伤作用    

5. GSDMD-NT介导的线粒体损伤需要OMM心磷脂

心磷脂由CRLS1合成，通过PLSCR3外化到OMM（图5A）。在脂多糖+尼日利亚菌素处理的Crls1-/–和Plscr3-/-iBMDM中，GSDMD-NT没有被招募到线粒体，线粒体的完整性和膜电位、线粒体数量和平均长度以及受损线粒体百分比几乎恢复到未处理的WT iBMDM的水平（图5B-5E）。此外，细胞色素c和线粒体DNA的胞质释放受阻（图5F-5I）。

6. OMM心磷脂促进焦亡、IL-1β释放和抗肿瘤免疫

与WT、iBMDMs相比，Plscr3-/-和Crls1-/-中靶向质膜的GSDMD、PI摄取和LDH释放减少了2倍以上（图5J-5M）。在小鼠巨噬细胞肿瘤细胞系J774中，Plscr3基因被去除（图5N）。与对照sgRNA转导的WT细胞相比，在Plscr3-/-/J774细胞中，脂多糖+尼日利亚菌素的焦亡明显减少（图5O）。尼日利亚菌素处理的Plscr3-/-/J774的肿瘤比尼日利亚菌素处理的WT J774的肿瘤生长更快，而MMC处理的J774细胞中PLSCR3缺乏并不影响肿瘤的生长（图5P）。    

图5 GSDMD介导的线粒体损伤、焦亡和抗肿瘤免疫反应需要OMM心磷脂

7. 活性氧和焦亡增加OMM心磷脂

通过抗心磷脂染色检查了从未经处理的细胞中分离的线粒体是否暴露于心磷脂（图6A和6B）。10%的分离线粒体被表面心磷脂染色，经Triton X-100渗透后，心磷脂染色增加7倍，表明分离的线粒体是完整的。在基线时，一些线粒体暴露心磷脂，使其可被GSDMD-NT获取。当分离的线粒体用活GSDMD-NT处理时，心磷脂外化在45分钟内显著增加（图6C）。线粒体氧化剂、抗霉素 A、鱼藤酮或羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）在分离的线粒体中诱导线粒体ROS，也会增加心磷脂暴露（图6D）。    

图6 OMM心磷脂在基础条件下暴露较弱，但对线粒体氧化剂或激活的GSDMD的反应增加    

8. 线粒体释放PNPT1导致细胞焦亡期间整体mRNA衰减

通过免疫荧光显微镜和分离细胞的免疫印迹分析了脂多糖和脂多糖+尼日利亚菌素处理的iBMDM中的PNPT1定位。用脂多糖处理后，PNPT1定位于细胞的线粒体中，但在用尼日利亚霉素处理后转移到细胞质中（图7A和7B）。通过荧光原位杂交，探测18S rRNA和Poly（A）mRNA，WT中mRNA信号不可检测，rRNA没有明显变化，但用尼日利亚霉素处理30分钟的Plscr3-/-和Crls1-/- iBMDM中没有（图7C和7D）。在WT中，在加入尼日利亚霉素后30分钟内或沙门氏菌感染后60分钟内，Actb、Tuba和Sdha管家基因mRNAs急剧下降，但不包括Plscr3-/-和Crls1-/- iBMDM（图7E）。此外，分别在Plscr3-/-和Crls1-/- iBMDM中异位表达WT PLSCR3和CRLS1，但不表达它们的非活性形式，可以恢复由尼日利亚霉素或沙门氏菌引起的焦亡mRNA的衰退（图7F和7G）。用尼日利亚霉素、脂多糖转染或沙门氏菌处理Plscr3-/-和Crls1-/- iBMDM。Pnpt1缺乏显著减弱细胞焦亡（图7H-7K）。接下来，检测WT或RNase缺陷型S484A PNPT1在Pnpt1-/- iBMDMs中的表达。在WT中，而不是RNase缺陷，PNPT1挽救了尼日利亚霉素诱导的焦亡，表明PNPT1介导的mRNA降解促进了焦亡（图7L）。    

图7 焦亡引起心磷脂依赖性PNPT1释放和mRNA衰变

文章总结

本研究表明线粒体损伤是细胞死亡的“不归路”，炎症激活的Gasdermin D与线粒体心磷脂结合形成线粒体孔，破坏线粒体膜，导致ROS，氧化磷酸化丧失，细胞毒性介质释放和线粒体自噬。如果你对这个研究方向感兴趣，不妨扫码来找小薇，生信分析，思路复现小薇都能实现，让你的研究之路更加顺畅！    

小薇公众号持续为大家带来最新医学思路，更多创新性分析思路点击往期推荐。想复现这种思路或者定制更多创新性思路欢迎直接call小薇，竭诚为您的科研助力！