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RNA测序（RNA-seq）已经成为分析基因差异表达和mRNAs差异剪接不可或缺的工具。随着下一代测序技术的发展，RNA-seq也在发展。

目前，RNA-seq方法可用于研究RNA生物学的许多不同方面，包括单细胞基因表达、翻译和RNA结构。随着直接RNA-seq技术和更好的数据分析工具的出现，RNA-seq的发展有助于更全面地理解生物科学，本文解读一篇2019年发表在Nature的RNA-sequencing综述。

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DGE：基因差异表达

流程 ：

RNA提取→mRNA富集或rRNA耗尽→cDNA合成→适配器连接→测序文制备→ 高通量平台（通常是Illumina）上进行测序，每个样本的读深度为1000万-3000万。

将测序读数对齐组合到一个反义读数→量化与转录本重叠的读数→样本之间的过滤和归一化→构建样本组之间单个基因或转录本表达水平的显著变化的统计模型。 早期的RNA-SEQ实验从大量组织中产生了DGE数据，并证明了它在广泛的生物和系统中的应用。

RNA-SEQ经常被用作不同的生物学应用，DGE分析（差异表达分析）仍然是RNA-SEQ的主要应用。

本文中，首先介绍了DGE的“基本准则”短读RNA-SEQ分析，然后将标准短读方法与新兴的长读RNA-SEQ和dRNA-SEQ技术进行比较。描述了短读排序建库的发展、实验设计和工作流。还有单细胞测序和空间分辨转录组分析。以及转录和翻译动力学、RNA结构、RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用的分析。 最后，讨论了RNA-SEQ未来可能的发展前景，单细胞测序和空间RNA-SEQ方法是否会像DGE分析一样成为常规？RNA-SEQ分析的长读可能在什么领域取代短读？

短读测序技术

目前短读测序技术已经成为常用的转录组检测方法，主要的核心步骤：RNA提取→cDNA合成→接头连接→PCR扩增→测序分析。由于片段化产生的cDNA长度通常小于200bp。例如illumina技术

长度测序技术

能够对单个RNA分子进行测序，减少序列测定中的歧义性，降低假阳性率。例如pacbio技术

长读直接测序技术

比较长读和短读技术

• 长读：缺点是通量低、错误率高。优点是能够读取单个转录本。
• 短读：优点是通量高，测序规模大，差异基因表达敏感性强。

长读测序的一个重要的问题——错误率比较高，如果每个样品被单独多次测序，再通过计算处理成一致序列，那么分子测序的次数的越多，错误程度越低。
长度测序的灵敏度受到三个因素影响：长RNA分子以全长转录组形式存在，即使低水平的RNA降解也会限制测序；文库制备技术限制，常用的逆转录酶无法满足实验需求；测序平台发展限制。

改进构建文库方法

RNA-seq最初用于分析聚腺苷酸转录本，方法源自于表达序列标签和微阵列研究。然而这些技术具有一定局限性。

• cDNA合成前对RNA进行片段化处理，提升丰度估计的准确性。
• 链特异性文库，测序时利用oligo-dT富集、UMIs特异性标注，利于实验分析。

富集poly（A）尾巴

富集3’端用于标记和选择

短读测序需要每个样本1000万-3000万的读数才能进行高质量的DGE分析，对于资源有限的朋友来说，可以考虑用3’-tag计数，降低成本同时得到更多数据。

每个转录本从3’端开始生成一个片段，标签的丰度与RNA浓度呈正比，这称为标签测序协议。

富集转录起始位点5’末端

TSS:转录起始位点

该法利用生物素化模板转换寡聚核苷酸产生cDNA,然后在5’端附近片段化，产生短cDNA标签。如果只用该法会产生大量假阳性TSS峰，建议使用正交法进行验证确认。

应用分子标识符检测PCR重复

UMIs:独特分子识别符，在文库制备过程中添加的短序列，其直接与RNA连接。

UMIs改善数据分析的错误率，放大偏差，消除可能导致等位基因频率计算错误的人工扩增制品，其正成为单细胞测序文库制备的标准工具之一。

改进降解RNA分析方法

文库制备的发展改善了对低质量或降解RNA的分析，以往的低质量RNA会导致基因覆盖不均匀、DGE假阳性高、重复率高。转录组文库构建可以用来降低RNA降解的影响。

设计更好的转录组实验

实验的设计对结论和数据至关重要，需要考虑复制次数、测序读取深度、单末端或者双末端读取的选择。

确定复制次数

足够多的生物复制能够获得更加精确的信息，解读生物变异性，任何高通量RNA实验都必须以复制的方式进行，在确定**复制次数时应该考虑到：效应大小、组内变异、预期假阳性率、最大样本量等。

确定正确的复制次数并不容易，对于高度多样化的样本，需要更多的复制，以确定变化规律。

确定读取深度

建库完成后，需要决定进行多深的测序？读取深度指每个样本获得的序列读取目标数目。真核生物DGE实验每个样本大约需要1000万-3000万左右。每个样本的读数能提供转录本丰度估计值，如果有足够的复制次数，那么较少的测序即可解决实验问题。

选择合适的参数

• 读取长度越长，测序DNA覆盖程度越高。对于定量分析如DGE时，长读没有太大作用。但对定性分析如异构体，则可能有帮助。
• 单末端读取和双末端读取也相类似，前者每个cDNA片段只产生一个序列，后者产生俩。若需要更多核苷酸覆盖度分析，长读和双末端测序是首选！DGE分析只需要计算读数映射，单末端测序即可确定大部分基因的源头，另外，双末端测序可以帮助解决映射歧义问题。

RNA-seq数据分析流程

↓ ↓ ↓转录组差异表达分析常用软件工具

分析序列读数的方法非常多，不同的工具和方法对结果产生不同影响，使用**的工具能帮助我们解决更多问题。DGE差异表达分析常用四个步骤，分别是： 对齐、组装、量化、归一化、构建模型。

第一步：序列对齐与组装

测序产生fastq格式原始文件，首先将序列映射到已知的转录组或者基因组，这个过程使用TopHat,STAR,HISAT等工具完成。测序的cDNA来自RNA，因此可能跨过外显子边界，执行剪切对比时，允许读数间隙。
如果没有高质量基因组注释可用或者希望映射到转录本时，可以使用StringTie,SOAPdenovo-Trans工具。

• 流程A：hisat→htseq→TMM→edgeR
• 流程B：Kallisto→TXI→TMM→DESeq2
• 流程C：tophat→cufflinks→cuffdiff2
  

第二步：转录本丰度量化

一旦序列读数被映射到转录组或基因组的位置上，即可将其分配到基因组或转录本确定丰度。量化采用的方法会对结果产生重大影响，利用转录组注释信息与已知的基因重叠信息进行计数，得出单个基因所有转录本异构体的丰度信息。
短读序列不会跨过剪接链接，因此不能分配明确的异构体，不同基因长度的异构体之间差异表达可能导致更准确的结果。
常用的工具：e RSEM,CuffLinks,MMSeq,HTSeq同源和重叠的转录本可能从分析中排除。

表达矩阵：Express Matrix
每一行是表达特征（基因或者转录本）
每一列是一个样本
值是实际读数或者估计丰度

第三步：过滤和归一化

通常，量化之后的读数也需要进行过滤和归一化，用来说明读取深度、表达模式、技术偏差之间的差异。

• 过滤：去除低丰度重复、改善检测结果
• 归一化：规范表达矩阵，转化丰度量，校正细微差异

尖峰控制：在处理前添加已知浓度的外源核酸序列，它们能够以不同浓度分布，用于检测反应效率和误差假阳性校正。

归一化的两个关键假设：

1. 多数基因表达水平在复制组间保持稳定
2. 不同样本在总mRNA水平没有显著差异

若以上两个假设不成立，则需要借助TMM均值修剪法，包括edgeR差异表达分析来弥补。
选择合适的归一化方法：尝试运用多种方式进行分析，对比结果的一致性，若差异较大，应进一步探索，找出差异来源。
另外一种解决方式是尖峰控制RNAs：在文库制备过程中，预先引入合适的外来RNA序列，尖峰插入RNA变异体，由于尖峰的浓度已知，读数和浓度呈正相关，因此可以用于校准样本的表达水平。
但是，实际过程中，在预定水平一致的插入尖峰很困难，在基因层面的读数比转录层面更可靠，因为异构体可以在样本中以不同的浓度表达。目前，尖峰控制并没有广泛使用，少量应用于单细胞测序领域。

第四步：差异表达建模

当序列被处理成表达矩阵后，实验即可被建模，从而确定哪些复制信息可能影响到表达水平。一些模型读取基因水平表达的计数，另一些模型依赖于转录水平的估计。前者以利于对齐的计数，并使用广义线性模型来进行评估。
工具：edgeR, DESeq2 and limma+voom
建模差异亚型表达量的工具：CuffDiff，MMSEQ，Ballgown。需要更多的计算量，结果也有较大变化。但是实际上前期的对齐、过滤、归一化等步骤对结果的影响更大！

超体RNA分析

标准的RNA seq分析是利用大量组织或者细胞进行的，不能保存空间三维信息和细胞类型，不利于我们理解生物的复杂性。为了能深入研究，大佬们提出了超RNA分析技术，如单细胞测序和空间转录组等。

单细胞测序

• 是否沿着转录本全长读取？
• 分析更多细胞（广度）还是分析每个细胞更多转录本（深度）？
• 实验成本如何？

单细胞测序的特点：
吞吐量较低，每个细胞都需要独立处理，允许用户选择性剪接和等位基因特异性表达，推断异构体的能力较差，需要从广度和深度两个方向考虑问题。
常用方法：平板或微流控制法（捕获少量细胞，但检测的基因多，形成单个数据集）
未来，单细胞测序可能会像今天转录组测序一样批量使用。。。

空间转录组测序

目前，转录组测序提供了详细的数据，但是无法获取空间信息，这是研究过程中的一大难题。空间组学的两种方法：空间编码和原位转录组学

目前需要解决的两个问题：

1. 改法只能用于新鲜组织
2. 分辨率有限制

上述技术不成熟，也有一些替代方法：单分子荧光原位杂交和基于成像法，能够产生更窄的图谱，直接检测RNA，同时提供组织结构和微环境信息。

超稳态RNA分析

DGE分析RNA-seq测量稳定的mRNA水平（通过平衡转录、加工、降解来维持），也可以用于转录和翻译过程和动力学研究。

新生RNA：Nascent RNA，指刚刚转录完成，未经加工运输的RNA。

用新生RNA测量活性转录

原生伸长转录测序：native elongating transcription sequencing (NET- seq)，缺乏特异性，可能会污染新生RNA富集。

核糖体图谱法测定活性翻译

RNA-seq重点关注样品中的mRNA种类和数量，但mRNA不一定直接对应蛋白质的产生。以下两种方法帮助理解“翻译体（从mRNA转化而来的完整蛋白质集合。

• 多核糖体分析法
• 基于RNA-seq的核糖体足迹法

上述两种方式能得知有多少个核糖体占据了一个转录本？以及它们在转录本上的分布。从而推断出特定情况下哪些转录本正在被翻译。

多核糖体图谱：利用离心技术分离多核糖体和单一核糖体结合的mRNA，制备文库，在多核糖体部分检测到更高的丰度，可以推断单mRNA的翻译状态。

Ribo-seq：基于RNA足迹发展而来，使用环六胺抑制翻译伸长，导致核糖体在链上停止，然后用RNase1来消除mRNA，留下20多个受到核糖体保护的核苷酸，受保护的RNA测序揭示核糖体的密度和位置，用于产生文库。通过分析能够识别单个mRNA分子的相对翻译、起始、延伸、终止。

RNA-seq的其他应用

RNA在调节分子互作的生物学过程中发挥重要作用，RNA-seq能够用于解决分子内和分子间RNA的相互作用，揭示结构信息，深入了解转录和翻译过程。

互作分析的共同主题： enrichment of RNA that is interacting relative to RNA that is not.

RNA结构和RNA-蛋白质互作

1.结构化分析：利用核酸酶或试剂探测结构化RNA（双链、dsRNA）和非结构化RNA（单链、ssRNA），核酸酶降解后残余RNA被转化为cDNA并测序，读取深度和反应性呈正比。

PARS:RNA结构并行分析（ parallel analysis of RNA structure）

2.化学作图：特异性修饰核糖核苷酸，标记阻断逆转录过程，导致cDNA截断，在修饰位点引起错掺突变，随后测序推断结构。

3.RRI分析法：RNA-RNA相互作用分析，首先将互作的RNA分子和生物素交联，然后进行富集，链接自由端，片段化之后制备文库，揭示相互作用的位点信息。

4.RNA-protein相互作用分析方法：RNA和蛋白质互作，交联免疫沉淀RNA后进行测序，利用UV紫外光辐射，在RNA和蛋白质间产生共价交联，片段化后，目标蛋白的抗体结合RNA，并链接适配器，提取cDNA，研究结构和互作体。

用分子内RNA互作探索RNA结构

查询RNA结构的方法有两种：核酸酶法和化学探测法

• 核酸酶法
  如RNA结构并行分析、片段测序，使用特异酶降解后制备文库，结构化和非结构化区域通过计算识别，但其分辨率低于化学法，同时其尺寸比较大。
• 化学探测法
  使用化学探针标记结构化或者非结构化区域，导致逆转录阻断或者cDNA误掺，测序揭示结构特征。探针是小分子，能够在体内确定，更具有生物学意义。还可以用于新生RNA分析和共转录RNA分析。

上述两种方法均产生短RNA片段，只报告单个位点，而误掺和突变检测法每次报告多个位点。所有方法都不是绝对有效，逆转录阻断法可能失败，化学标记可能突变，尖峰控制能提高检测质量却未普及。

这些方法都说明了RNA结构对基因和互作起到的重要作用。

分子间RNA的相互作用

全转录组法和靶向法类似，相互作用的RNAs在体内交联并富集，富集减少进入反应的RNA数量，起到调节作用。

RNA和蛋白质互作

• RNA和蛋白互作的温和洗涤条件下，许多非特异性结合片段也被富集。
• RNA断裂的缺失降低了结合位点的分辨率。

254nm紫外光交联剂介绍：能够在互作位点上产生共价键，并且不会交联蛋白质间互作，稳定了RNA和蛋白质的结合，允许严格富集，破坏天然RNA和蛋白质的互作，减少背景信号。

结论

文献：RNA sequencing: the teenage years，Nature Reviews Gentics，2019

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